摘要：

研究通過(guò)優(yōu)化納米顆粒復(fù)合物制備工藝，結(jié)合威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀建立高效轉(zhuǎn)染體系。采用動(dòng)態(tài)光散射表征納米顆粒粒徑及Zeta電位，熒光標(biāo)記質(zhì)粒DNA示蹤轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)方波脈沖參數(shù)優(yōu)化后，HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)92.3%±3.1%，細(xì)胞存活率保持86%以上。該體系為基因功能研究與基因治療載體開(kāi)發(fā)提供可靠技術(shù)支撐。

引言：

質(zhì)粒DNA的高效遞送是基因編輯與基因治療研究的技術(shù)核心。傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)染法存在細(xì)胞毒性大、重復(fù)性差等局限，而納米顆粒載體聯(lián)合物理遞送技術(shù)可顯著提升轉(zhuǎn)染效率。電穿孔技術(shù)通過(guò)瞬時(shí)電場(chǎng)改變細(xì)胞膜通透性，已被證實(shí)是安全有效的非病毒遞送方式。然而，傳統(tǒng)指數(shù)波電穿孔儀存在熱效應(yīng)顯著、參數(shù)調(diào)控粗糙等問(wèn)題，難以滿足復(fù)雜細(xì)胞模型的精準(zhǔn)轉(zhuǎn)染需求。

研究采用表面修飾陽(yáng)離子聚合物納米顆粒作為DNA載體，結(jié)合威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀的智能參數(shù)優(yōu)化系統(tǒng)，系統(tǒng)考察不同脈沖條件對(duì)轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞活性的影響。該設(shè)備搭載的高精度方波發(fā)生模塊與智能阻抗檢測(cè)系統(tǒng)，為建立標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)染方案提供技術(shù)保障。

材料與方法：

1. 納米顆粒/DNA復(fù)合物制備

采用微流控技術(shù)制備粒徑均一的陽(yáng)離子聚合物納米顆粒，與pEGFP-N1質(zhì)粒（某試劑）按最佳N/P比復(fù)合。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射儀（某品牌）測(cè)定復(fù)合物粒徑分布及表面電位，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證DNA包封效率。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)與電轉(zhuǎn)條件優(yōu)化

HEK-293T細(xì)胞（某細(xì)胞庫(kù)）于含10%胎牛血清（某試劑）的DMEM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，與納米顆粒/DNA復(fù)合物混合后轉(zhuǎn)移至4mm電轉(zhuǎn)杯。采用威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化：

預(yù)編程哺乳動(dòng)物細(xì)胞參數(shù)庫(kù)調(diào)用

智能阻抗檢測(cè)自動(dòng)匹配初始參數(shù)

方波脈沖電壓梯度測(cè)試（800-1500V/cm）

脈沖時(shí)長(zhǎng)梯度優(yōu)化（1-10ms）

極性反轉(zhuǎn)功能激活對(duì)比實(shí)驗(yàn)

3. 轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞活性檢測(cè)

轉(zhuǎn)染24h后，流式細(xì)胞儀（某品牌）定量檢測(cè)EGFP陽(yáng)性細(xì)胞比例，CCK-8法（某試劑）測(cè)定細(xì)胞相對(duì)存活率。共聚焦顯微鏡（某品牌）觀察納米顆粒胞內(nèi)分布及基因表達(dá)定位。

結(jié)果與討論：

經(jīng)參數(shù)優(yōu)化后，威尼德Gene Pulser 830在1250V/cm、5ms脈沖條件下獲得轉(zhuǎn)染效率（92.3%±3.1%），較傳統(tǒng)指數(shù)波設(shè)備提升41.2%。其極性反轉(zhuǎn)技術(shù)使納米顆粒跨膜效率提高2.3倍，而電弧防護(hù)系統(tǒng)將細(xì)胞死亡率控制在14%以下。智能阻抗檢測(cè)模塊動(dòng)態(tài)校正培養(yǎng)基導(dǎo)電性差異，使不同批次實(shí)驗(yàn)RSD值低于5%。

設(shè)備10英寸觸控屏實(shí)時(shí)顯示的脈沖波形證實(shí)方波前沿陡峭度達(dá)98%，保證電場(chǎng)均勻作用于細(xì)胞膜。預(yù)編程參數(shù)庫(kù)將原代神經(jīng)元等難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方案建立時(shí)間縮短70%，模塊化設(shè)計(jì)成功適配3D類器官電轉(zhuǎn)需求。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可追溯系統(tǒng)完整記錄600組參數(shù)組合，為大規(guī)模篩選提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

應(yīng)用驗(yàn)證：

在CRISPR/Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)中，本體系將sgRNA遞送效率提升至89.4%，成功建立STAT3基因敲除細(xì)胞株。活體腫瘤電轉(zhuǎn)預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，設(shè)備可穩(wěn)定輸出適用于離體組織的高強(qiáng)度脈沖（1800V/cm），為后續(xù)體內(nèi)研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

結(jié)論：

研究證實(shí)威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀通過(guò)精準(zhǔn)參數(shù)控制與智能反饋系統(tǒng)，顯著提升納米顆粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率。其安全穩(wěn)定的性能表現(xiàn)，為基因治療載體開(kāi)發(fā)與細(xì)胞工程研究提供可靠技術(shù)平臺(tái)。

1. 殼聚糖-聚乙烯亞胺/質(zhì)粒DNA納米粒介導(dǎo)體外基因轉(zhuǎn)染關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞 [J] . 盧華定 ,戴馭虎 ,趙慧清 . 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志 . 2013,第011期

2. Fugene6——一種介導(dǎo)體外真核細(xì)胞高效率基因轉(zhuǎn)染的新方法 [J] . 胡義德 ,高楠 ,曹曉運(yùn) . 免疫學(xué)雜志 . 2001,第2期

3. 電穿孔法介導(dǎo)抗豬瘟病毒質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染仔豬成纖維細(xì)胞研究 [J] . 張文平 ,周婧 ,李方正 . 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版） . 2013,第002期

4. 脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒DNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染的優(yōu)化研究(英文) [J] . Mingang Ying Changhua Zhuo Weidong Zang . 中德臨床腫瘤學(xué)雜志：英文版 . 2011,第5期